Wstęp

Przewlekła polineuropatia zapalna jest chorobą autoimmunologiczną obwodowego układu nerwowego, w której białka osłonki mielinowej są głównym celem ataku układu odpornościowego. W trakcie aktywnej fazy przewlekłej zapalnej poliradikuloneuropatii demielinizacyjnej biopsja nerwów wykazuje nacieki w onerwiu zawierające limfocyty T oraz zależną od makrofagów demielinizację. Zarówno limfocyty T jak i makrofagi mogą wydzielać prozapalne cytokiny, które wzbudzają cytotoksyczność prowadząc do uszkodzenia mieliny, komórek Schwanna oraz aksonów [1,2,3]. W trakcie toczącego się procesu autoimmunologicznego obecne w pniu nerwu limfocyty Th1 wydzielają prozapalne cytokiny takie jak TNF-alfa, IL-2 czy interferon-gamma, które stymulują komórkowe mechanizmy odporności, leżące u podłoża obserwowanej w CIDP demielinizacji [1,2,3]. Limfocyty Th2 wydzielają cytokiny takie jak IL-4, IL-5, IL-6, IL-9 i IL-10, z jednej strony hamując aktywność limfocytów Th1, a z drugiej stymulując aktywność limfocytów B, produkujących przeciwciała [2,3].
Dożylnie immunoglobuliny są uznaną metodą leczenia zespołu Guillain-Barre, CIDP i szeregu innych chorób autoimmunologicznych [4]. Jakkolwiek mechanizm działania dożylnych immunoglobulin nie został dotychczas dokładnie ustalony, wyniki badań eksperymentalnych wskazują, że dożylne immunoglobuliny działają wielokierunkowo poprzez wpływ na indukcję i fazę efektorową odpowiedzi immunologicznej oraz na namnażanie komórek odpornościowych [1,3].
Dożylne immunoglobuliny hamują zależną od przeciwciał odporność komórkową [5], zmniejszają aktywność komórek NK [6], zmniejszają produkcję przeciwciał [7], neutralizują krążące przeciwciała [8] i hamują aktywację dopełniacza [9]. Powyższe mechanizmy są zależne od obecności w stosowanych preparatach przeciwciał klasy IgG, których okres półtrwania wynosi 3 tygodnie [1]. Ponadto obserwowane jest długotrwałe działanie immunomodulujące dożylnych immunoglobulin, za które może być odpowiedzialny wpływ immunoglobulin na fazę amplifikacji reakcji immunologicznej; szczególnie namnażania limfocytów T [1]. W badaniach na zwierzętach wykazano, że immunoglobuliny hamują rozwój chorób autoimmunologicznych pomimo zachowanej reaktywności limfocytów T przeciwko autoantygenom [1]. Wyniki tych badań sugerują, że przynajmniej za część efektu leczniczego dożylnych immunoglobulin odpowiedzialne może być hamowanie uwalniania bądź produkcji prozapalnych cytokin.
Prozapalne cytokiny TNF-alfa, IL1B i IL-6 mogą być produkowane przez aktywowane limfocyty T i makrofagi i mają istotną rolę w patogenezie CIDP i jej ostrej formy zespołu Guillain-Barre [1,2,3,10]. Działanie prozapalnych cytokin jest hamowane przez naturalne przecizapalne cytokiny takie jak rozpuszczalny receptor TNF-alfa (sTNFRs) i IL-10, która ma potencjał hamujący na proliferację aktywowanych limfocytów i makrofagów oraz na produkcję przez nie cytokin [1,3,11]. IL-10 hamuje wydzielanie TNF-alfa oraz IL-1B [2,3].
U pacjentów z HIV i ziarnicą Wegenera obserwowano wzrost poziomu IL-10 po podaniu dożylnych immunoglobulin [2,12].
Preparaty dożylnych immunoglobulin zawierają przeciwciała przeciwko szerokiemu spektrum antygenów, w tym przeciwciała wiążące się z cytokinami takimi jak Interferon alfa, Interleukina 1a oraz IL-6, a co za tym idzie obserwowany jest spadek poziomu tych cytokin po podaniu dożylnych immunoglobulin [1,11].



Cel
Celem pracy było ustalenie mechanizmu leżącego u podłoża immunomodulującego działania dożylnych immunoglobulin u chorych z przewlekłą polineuropatią zapalną, przez określenie czy kuracja dożylnymi immunoglobulinami w dawce 5g u pacjentów z przewlekłą polineuropatią zapalną wywiera wpływ na produkcję i wydzielanie cytokin: prozapalnej IL-6 i przeciwzapalnej IL-10.

Materiały:

Do badania włączono 7 pacjentów (1 kobietę i 6 mężczyzn) w wieku od 31 – 74 lat (średnio 55.89 lat, SD 13.58 lat) z rozpoznaną w oparciu o kryteria elektrofizjologiczne przewlekłą polineuropatią zapalną, chorujących od co najmniej 2 lat. Kryteria elektrofizjologiczne rozpoznawania polineuropatii obejmowały (AAN 1992):
• redukcję szybkości przewodzenia w 2 lub więcej nerwach ruchowych
< 80% dolnej granicy normy o ile amplituda CMAP pozostaje >80% dolnej granicy normy
< 70% dolnej granicy normy o ile amplituda CMAP pozostaje <80% dolnej granicy normy
• Przedłużenie latencji dystalnych w 2 lub więcej nerwach
>125% górnej granicy normy górnej granicy normy o ile amplituda jest >80% dolnej granicy normy
>150% górnej granicy normy górnej granicy normy o ile amplituda jest <80% dolnej granicy normy
• Brak fali F lub przedłużenie latencji fali F w przynajmniej 2 lub więcej nerwach
>120% górnej granicy normy górnej granicy normy o ile amplituda jest >80% dolnej granicy normy
>150% górnej granicy normy górnej granicy normy o ile amplituda jest <80% dolnej granicy normy
• Częściowy blok przewodzenia w jednym lub więcej nerwie
U 5 pacjentów obserwowano postać przewlekle postępującą czuciowo-ruchowej polineuropatii zapalnej, u jednego nawracająco-zwalniająca, a w jednego pacjenta polineuropatia przebiegała pod postacią rzadkiego wariantu CIDP; przewlekłej polineuropatii czuciowo-ruchowej z wieloogniskowym blokiem przewodzenia (MADSAM).
U części pacjentów stosowana była przewlekła terapia immunosupresyjna; 5 stosowało Azatioprynę w dawce 100mg dzienie, 5 stosowało Encorton w dawkach od 20 – 30mg dziennie, w tym 4 pacjentów stosowało oba leki jednocześnie, a jeden pacjent pozostawał bez terapii immunosupresyjnej. U żadnego z pacjentów nie stosowano terapii dożylnymi immunoglobulinami w ciągu 2 miesięcy poprzedzających badanie oraz żaden z pacjentów nie przebył infekcji w ciągu 2 tygodni poprzedzających badanie.
Stan kliniczny pacjentów oceniano pięciopunktową zmodyfikowaną skalą funkcjonalną Rankina;
0 – pacjent w pełni sprawny
1- objawy polineuropatii nie powodujące niesprawności i niewymagające zmiany stylu życia
2- objawy polineuropatii powodujące niewielka niesprawność wymuszająca ograniczenia w dotychczasowym trybie życia, ale nie powodującą utraty samodzielności
3- objawy polineuropatii powodujące średniego stopnia niesprawność wyraźnie wpływająca na styl życia oraz powodująca utratę całkowitej samodzielności
4 – objawy polineuropatii powodujące znaczną niesprawność powodująca całkowitą zależność od innych osób, ale chory nie wymaga stałej opieki w ciągu dnia i w nocy
5- objawy polineuropatii powodujące znaczną niesprawność powodująca całkowitą zależność od innych osób; pacjent wymaga stałej opieki 24-godziny na dobę
4 pacjentów zgłaszało niesprawność odpowiadającą 3 stopniowi w skali Rankina, dwóch drugiemu stopniowi w skali Rankina i jeden pierwszemu stopniowi w skali Rankina.
U wszystkich pacjentów wcześniej wykluczone zostały inne potencjalne przyczyny polineuropatii.

Metody.

Wszystkim pacjentom, w powolnym wlewie dożylnym trwającym 2 godziny, podano 5 g dożylnych immunoglobulin. U wszystkich pacjentów przeprowadzono badanie ogólnolekarskie, szczegółowe badanie neurologiczne, ze szczególnym uwzględnieniem objawów uszkodzenia obwodowego układu nerwowego oraz kontrolne badanie elektroneurografiiczne. Przed przetoczeniem dożylnych immunoglobulin i w 24 godziny po przetoczeniu od wszystkich pacjentów pobrano krew do badań laboratoryjnych obejmujących; morfologię krwi, współczynnik sedymentacji krwinek czerwonych, poziom CRP, AspAT, AlAt, CPK, Na, K, Cl, glukozy, bilirubiny, kreatyniny, współczynników INR i APTT oraz poziom IL-6 i IL-10. U wszystkich pacjentów wykonano jednorazowo badanie ogólne oraz osadu moczu.
Poziomy interleukin zostały ocenione przy pomocy metody EIA z użyciem komercyjnie dostępnych testów produkcji Bender-Med Systems.
Wyniki poziomów interleukin przed i po podaniu dożylnych immunoglobulin zostały porównane i istotność obserwowanych zmian została oceniona przy użyciu testu T-studenta.

Wyniki:
Interleukiny:
Poziom interleukiny 6 przed przetoczeniem 5g dożylnych immunoglobulin wynosił 0.18 – 1.26 (średnio 0.64 SD 0.47). W 24 h po przetoczeniu 5g dożylnych immunoglobulin poziom interleukiny 6 wynosił 0.19-1.31 (średnio 0.41 SD 0.46).
Poziom interleukiny 10 przed przetoczeniem 5g dożylnych immunoglobulin wynosił 0.16 – 5.61 (średnio 2.28 SD 1.77). W 24 h po przetoczeniu 5g dożylnych immunoglobulin poziom interleukiny 6 wynosił 0.10-6.68 (średnio 4.39 SD 2.50).
Wzrost poziomu interleukiny-10 24h po podaniu dożylnych immunoglobulin był znamienny statystycznie (p<0,05). Obserwowany spadek poziomu interleukiny-6 w 24 h po podaniu dożylnych immunoglobulin okazał się nieznamienny statystycznie (p<0.13).
ENG:
Wszyscy pacjenci spełnili kryteria elektrofizjologiczne neuropatii demielinizacyjnej. U 5 pacjentów obserwowano poprawę parametrów przewodzenia w porównaniu do wcześniej wykonanego badania ENG, u 2 w parametrach ENG nie obserwowano istotnych zmian.
Badania laboratoryjne:
U żadnego z pacjentów nie obserwowano nieprawidłowych wyników w zakresie morfologii, poziomu elektrolitów, CRP, AspAt, AlAt, glukozy, bilirubiny, kreatyniny, INR i APTT zarówno przed, jak i po przetoczeniu immunoglobulin. 5 pacjentów miało podwyższony współczynnik sedymentacji erytrocytów i 5 miało podwyższony poziom CPK (poziomy od 54 – 792 U/l średnio 299.44 U/l, SD 262.9 U/l).

Dyskusja.
Obserwowany u naszych pacjentów spadek poziomu prozapalnej IL-6 i wzrost poziomu przeciwzapalnej IL-10 potwierdza immunomodulujący wpływ dożylnych immunoglobulin, który może być odpowiedzialny za ich działanie terapeutyczne. Dotychczas opublikowane wyniki badań nad wpływem dożylnych immunoglobulin na poziomy cytokin miały sprzeczne wyniki. Najczęściej były to badania przeprowadzane in vitro [9,13,14] lub dotyczyły wpływu dużych dawek immunoglobulin na cytokiny w ostrej postaci polineuropatii zapalnej jaką jest zespół Guillain-Barre [1,13,15].
Nasze badanie dotyczyło pacjentów z przewlekłą polineuropatią zapalną podczas klinicznej stabilizacji choroby, co pozwoliło na obserwację zmian poziomów cytokin pod wpływem dożylnych immunoglobulin w okresie, kiedy nie dochodzi do ich gwałtownych zmian poziomów cytokin spowodowanych burzliwie przebiegającymi reakcjami autoimmunologicznymi. Pozwala to na uniknięcie problemów z rozróżnieniem zmian poziomów cytokin pod wpływem dożylnych immunoglobulin od zmian cytokin w naturalnym przebiegu choroby autoimmunologicznej. Większość z naszych pacjentów stosowała terapię immunospresyjną, pod postacią prednizonu (20-30mg/dziennie) lub Azathiopryny (100mg/dziennie) lub obu tych leków, która poza leczniczym działaniem hamującym na reakcję autoimmunologiczną, będącą istotą przewlekłej polineuropatii zapalnej, mogła wpłynąć na reakcję „sieci” cytokin na infuzję dożylnych immunoglobulin i mogła być częściowo odpowiedzialna za nieosiągnięcie znamienności statystycznej przez szeroko opisywany we wcześniejszych pracach spadek poziomu interleukiny 6.
Interleukina 6 jest wielokierunkowo działającą cytokiną, wydzielaną przez limfocyty T i makrofagi, która między innymi ma stymulujący wpływ na produkcję przeciwciał przez limfocyty B [1,2,3]. Podwyższone poziomy IL-6 obserwowane były w zaostrzeniach zespołu POEMS (polineuropatia, organomegalia, endokrynopatia, obecność białka M) [16] oraz w zespole Guillain-Barre [1]. Zarówno w badaniach in vitro [9,13,14], jak i in vivo w zespole Guillain-Barre [1,15] obserwowano spadek poziomu IL-6 po podaniu preparatów ludzkich immunoglobulin immunoglobulin. Badania in-vitro wskazują na zmniejszenie produkcji IL-6 przez makrofagi pod wpływem nieznanych czynników immunomodulujących zawartych w preparatach immunoglobulin [13,14]. W badaniach in-vivo obserwowano wzrost poziomu przeciwciał przeciwko IL-6, z jednoczesnym spadkiem poziomu IL-6, po podaniu dożylnych immunoglobulin [11], co może być dodatkowym mechanizmem prowadzącym do spadku poziomu IL-6, jednak nie tłumaczy utrzymującej się przez dłuższy czas redukcji stężeń IL-6 w surowicy pacjentów. We wcześniejszych publikacjach rozważano bezpośredni wpływ uszkadzający dożylnych immunoglobulin na aktywowane limfocyty T i inne komórki produkujące prozapalne cytokiny, w tym IL-6 [1], jednakże nie znaleziono dotychczas dowodów na niszczenie tych komórek po podaniu immunoglobulin, a rosnący poziom IL-2, która jest produkowana przez aktywowane limfocyty T w fazie efektorowej reakcji immunologicznej [1], świadczy przeciwko tej teorii. Innym sugerowanym mechanizmem działania dożylnych immunoglobulin na produkcję cytokin jest kumulacja immunoglobulin w otoczeniu limfocytów co może być sygnałem do zaprzestania produkcji zapalnych cytokin przez limfocyty T [17].
Interleukina 10 jest cytokiną produkowaną między innymi przez limfocyty Th, która ma hamujący wpływ na produkcję prozapalnych cytokin takich jak TNF-alfa oraz IL-1b [1,2,3]. Poziom IL-10 podczas reakcji zapalnej podnosi się jako jeden z ostatnich, co najprawdopodobniej odzwierciedla naturalny mechanizm regulujący aktywność TNF-alfa [1,3].
Wzrost poziomu IL-10 obserwowano w aktywnej fazie chorób autoimunologicznych takich zespół POEMS [16] i zespół Guillain-Barre [1]. Towarzyszył on zwiększonemu poziomowi TNF-alfa oraz korelował pozytywnie z uszkodzeniem aksonalnym. IL-10 ma działanie hamujące na wydzielanie TNF-alfa, wzrost poziomu IL-10 jest najprawdopodobniej wtórny do wzrostu poziomu tej prozapalnej cytokiny i ma na celu ograniczenie kaskadowo narastających procesów auto-immunologicznych [1,3].

Wnioski:
Zaobserwowaliśmy znamienny statystycznie wzrost poziomu IL-10 oraz nieznamienny spadek IL-6 po podaniu dożylnych immunoglobulin w dawce 5g u pacjentów chorujących na przewlekłą polineuropatię zapalną.
Dokładne zrozumienie mechanizmów działania dożylnych immunoglobulin mogą prowadzić do bardziej efektywnych sposobów leczenia chorób autoimmunologicznych układu nerwowego. Nasze wyniki badań sugerują, że dożylne immunoglobuliny mają wpływ immunomodulujący zwiekszając poziom przecizapalnej interleukiny 10. Prawdopodobnie po zwiększeniu grupy badanych potwierdzi się również wpływ hamujący na produkcję prozapalnej interleukiny 6. Obserwowane immunomodulujące działanie dożylnych immunoglobulin, może być odpowiedzialne za ich unikalny wpływ na układ odpornościowy; hamujący patologiczną reakcję autoimmunologiczną, bez jednoczesnych niedoborów odporności jako objawów ubocznych terapii.