Stwardnienie rozsiane jest zapalną choroba demielinizacyjną ośrodkowego układu nerwowego na podłożu autoimmunologicznym. Obserwowane są w niej charakterystyczne zaburzenia sieci cytokin we krwi obwodowej, płynie mózgowo-rdzeniowym oraz tkance mózgowej [1-9]. W związku z tym, że cytokiny uważane są za najsilniejsze substancje regulujące układ odpornościowy, związek pomiędzy poziomami cytokin a aktywnością procesów uszkadzających w stwardnieniu rozsianym jest obecnie przedmiotem wielu badań [1-9]. Ostre zaburzenia równowagi pomiędzy pro i przeciwzapalnymi cytokinami uważane jest za istotny czynnik w patomechaniźmie zmian demielinizacyjnych ośrodkowego układu nerwowego powstających w czasie ostrego nawrotu stwardnienia rozsianego, w trakcie którego obserwowany jest wzrost poziomów prozapalnych cytokin takich jak interferon-gamma, TNF-alfa, TNF-beta oraz interleukina 6 oraz spadek przeciwzapalnych cytokin takich jak interleukina 4 i interleukina 10 [1-8].
Podawane dożylnie preparaty ludzkich immunoglobulin są uznaną metodą leczenia szeregu chorób autoimmunologicznych, w tym również neurologicznych, takich jak zespół Guillain Barre, przewlekła polineuropatia zapalna i miastenia [9-13]. W stwardnieniu rozsianym dożylne immunoglobuliny są jedną z alternatywnych metod terapii [2-9]. Jakkolwiek mechanizm działania dożylnych immunoglobulin nie został dotychczas dokładnie ustalony, wyniki badań eksperymentalnych wskazują, że dożylne immunoglobuliny działają wielokierunkowo, między innymi wywierają wpływ hamujący na indukcję i fazę efektorową odpowiedzi immunologicznej oraz na namnażanie komórek odpornościowych [10,12].
Dożylne immunoglobuliny hamują zależną od przeciwciał odporność komórkową [14], zmniejszają aktywność komórek NK [15], zmniejszają produkcję przeciwciał [16], neutralizują krążące przeciwciała [17] i hamują aktywację dopełniacza [18]. Powyższe mechanizmy są zależne od obecności w stosowanych preparatach przeciwciał klasy IgG, których okres półtrwania wynosi 3 tygodnie [10]. Ponadto obserwowane jest długotrwałe działanie immunomodulujące dożylnych immunoglobulin, za które może być odpowiedzialny wpływ immunoglobulin na fazę amplifikacji reakcji immunologicznej, a szczególnie namnażania limfocytów T [10]. W badaniach na zwierzętach wykazano, że immunoglobuliny hamują rozwój chorób autoimmunologicznych pomimo zachowanej reaktywności limfocytów T przeciwko autoantygenom [10]. Wyniki tych badań sugerują, że przynajmniej za część efektu leczniczego dożylnych immunoglobulin odpowiedzialne może być hamowanie uwalniania bądź produkcji prozapalnych cytokin.
Prozapalne cytokiny TNF-alfa, IL1B i IL-6 mogą być produkowane przez aktywowane limfocyty T i makrofagi [14]. Działanie prozapalnych cytokin jest hamowane przez naturalne przecizapalne cytokiny takie jak rozpuszczalny receptor TNF-alfa (sTNFRs) i IL-10, która ma potencjał hamujący na proliferację aktywowanych limfocytów i makrofagów oraz na produkcję przez nie cytokin [10,12,19]. IL-10 hamuje wydzielanie TNF-alfa oraz IL-1B.
U pacjentów z HIV i ziarnicą Wegenera obserwowano wzrost poziomu IL-10 po podaniu dożylnych immunoglobulin [11,20], a w badaniach in vitro, z wykorzystaniem krwi pacjentów chorujących na stwardnienie rozsiane wykazano zależny od dawki wpływ dożylnych immunoglobulin na układ cytokin: stwierdzono hamujący wpływ na prozapalne cytokiny (IFN-gamma i TNF) oraz stymulujący na przecizapalną interleukinę 10 [22].
Preparaty dożylnych immunoglobulin zawierają przeciwciała przeciwko szerokiemu spektrum antygenów, w tym przeciwciała wiążące się z cytokinami takimi jak Interferon alfa, Interleukina 1a oraz IL-6, a co za tym idzie obserwowany jest spadek poziomu tych cytokin po podaniu dożylnych immunoglobulin [10,15].

Cel

Celem pracy było ustalenie mechanizmu leżącego u podłoża immunomodulującego działania dożylnych immunoglobulin, przez określenie wpływu dożylnych immunoglobulin podawanych w dawce 2,5g u pacjentów ze stwardnieniem rozsianym, na stężenia cytokin: prozapalnej IL-6 i przeciwzapalnej IL-10.

Materiał

Do badania włączono 9 pacjentów (7 kobiet i 2 mężczyzn) w wieku od 23-42 lat (średnio 31,11 SD 5.93) chorujących na stwardnienie od conajmnej 4 lat. U wszystkich pacjentów rozpoznano postać nawracająco-zwalniającą stwardnienia rozsianego.
Warunkiem włączenia do badania było spełnienie kryteriów klinicznych oraz radiologicznych rozpoznania pewnego stwardnienia rozsianego.
Kryteria kliniczne (wg Schumachera) obejmowały :
1. Wykazanie w badaniu neurologicznym lub w wywiadzie chorobowym objawów wskazujących na obecność 2 lub więcej ognisk w OUN.
2. Zwalniający przebieg choroby; 2 lub więcej epizodów w odstępie czasowym ponad jednego miesiąca, trwające minimum 24 godziny.
3. Postępujący przebieg – przetrwałe pogorszenie przez 6 miesięcy.
4. Początek choroby w wieku od 10-go – 50-go roku życia.
5. Brak innego wytłumaczenia dla objawów choroby
Kryteria rozpoznawania stwardnienia rozsianego za pomocą rezonansu magnetycznego (wg. Fazekasa i Paty’ego) obejmowały :
1. Stwierdzenie ognisk demielinizacyjnych o średnicy>6 mm.
2. Stwierdzenie 4 lub więcej ognisk w istocie białej.
3. Stwierdzenie minimum 1 ogniska zlokalizowanego okołokomorowo, w ciele modzelowatym lub podnamiotowo.
4. Owalny kształt ogniska lub ognisk w pobliżu komór bocznych.
Kryteriami wykluczenia było stosowanie leków modyfikujących działanie układu odpornościowego, w tym stosowanie terapii dożylnymi immunoglobulinami w ciągu 2 miesięcy poprzedzających badanie, przebycie infekcji w ciągu 2 tygodni poprzedzających wlew dożylnych immunoglobulin oraz nawrót stwardnienia rozsianego w ciągu 2 miesięcy poprzedzających badanie.
Stan kliniczny pacjentów oceniono za pomocą 10-punktowej skali EDSS:
0 Prawidłowe badanie neurologiczne
1.0 Bez upośledzenia czynności minimalne objawy w jednym punkcie FS
2.0 Minimalne upośledzenie czynności w jednym punkcie FS
3.0 Umiarkowane upośledzenie w jednym punkcie FS albo łagodne upośledzenie w czynności w 3 lub 4 punktach FS; chory w pełni chodzący
4.0 Chory w pełni chodzący bez pomocy oraz samoobsługujący się powyżej 12 godzin dziennie, pomimo stosunkowo ciężkiego upośledzenia czynności, na który składa się zwykle jeden punkt FS o stopniu 4, zdolny do przejścia 500 metrów bez pomocy lub odpoczynku.
5.0 Chory zdolny do przejścia bez pomocy lub odpoczynku około 200 metrów, niewydolność ruchowa wystarczająco ciężka aby upośledzić całkowicie codzienne czynności
6.0 Stosowane okresowe lub jednostronne stałe wspomaganie (laska, kula, podciąg) konieczne do przejścia około 100 metrów z lub bez odpoczynku
7.0 Chory niezdolny do przejścia ponad 5 metrów nawet z pomocą: poruszający się głównie na wózku - przebywa na nim ponad 12 godzin dziennie
8.0 Chory porusza się jedynie na wózku lub jest nim wożony, ale przebywa poza wózkiem przez większość dnia; zachowanych wiele czynności samoobsługi zazwyczaj potrafi efektywnie używać kończyn górnych
9.0 Chory leżący bezradny, może porozumiewać się i jeść
10.0 Śmierć z powodu stwardnienia rozsianego
Badanych pacjentów oceniono w skali EDSS na 2.0-4.0 pkt..

Metody

Wszystkim pacjentom, w powolnym wlewie dożylnym trwającym 1 godzinę, podano 2,5 g dożylnych immunoglobulin. Przed przetoczeniem dożylnych immunoglobulin i w 24 godziny po przetoczeniu od wszystkich pacjentów pobrano krew do badań laboratoryjnych obejmujących oznaczenie; morfologii krwi, współczynnika sedymentacji krwinek czerwonych, poziomu CRP, AspAT, AlAt, CPK, Na, K, Cl, glukozy, bilirubiny, kreatyniny, współczynników INR i APTT oraz poziomu IL-6 i IL-10. U wszystkich pacjentów wykonano jednorazowo badanie ogólne oraz osadu moczu.
Poziomy interleukin zostały ocenione przy pomocy metody EIA poziomów użyciem komercyjnie dostępnych testów produkcji Bender-Med Systems.
Wyniki poziomów interleukin przed i po podaniu dożylnych immunoglobulin zostały porównane i istotność obserwowanych zmian została oceniona przy użyciu testu T-studenta.
U wszystkich pacjentów przeprowadzono badanie ogólnolekarskie, szczegółowe badanie neurologiczne, ze szczególnym uwzględnieniem objawów uszkodzenia ośrodkowego układu nerwowego oraz kontrolne badanie wzrokowych, somatosensorycznych oraz słuchowych potencjałów wywołanych.

Wyniki:

Interleukiny:
Poziom interleukiny-6 przed przetoczeniem 2,5g dożylnych immunoglobulin wynosił 0.03 – 0.56 (średnio 0.23 SD 0.19). W 24 h po przetoczeniu 5g dożylnych immunoglobulin poziom interleukiny 6 wynosił 0.02-1.05 (średnio 0.31 SD 0.37). Wzrost poziomu interleukiny-6 24h po podaniu dożylnych immunoglobulin był nieznamienny statystycznie (p<0,26).
Poziom interleukiny 10 przed przetoczeniem 2,5g dożylnych immunoglobulin wynosił 0.06 – 2.06 (średnio 0.90 SD 0.74). W 24 h po przetoczeniu 5g dożylnych immunoglobulin poziom interleukiny 10 wynosił 0.02-2.24 (średnio 0,80 SD 0,93). Obserwowany spadek poziomu interleukiny-10 w 24 h po podaniu dożylnych immunoglobulin również był się nieznamienny statystycznie (p<0.39).
Potencjały wywołane:
U żadnego z pacjentów nie obserwowano pogorszenia parametrów w wykonanych badaniach potencjałów wywołanych wzrokowych, słuchowych i somatosensorycznych w porównaniu do wcześniej wykonanych badań kontrolnych (2-6 miesięcy) .
Badania laboratoryjne:
U żadnego z pacjentów nie obserwowano nieprawidłowych wyników w zakresie morfologii, poziomu elektrolitów, CRP, AspAt, AlAt, glukozy, bilirubiny, kreatyniny, INR i APTT zarówno przed, jak i po przetoczeniu immunoglobulin. 5 pacjentów miało podwyższony współczynnik sedymentacji erytrocytów i 5 miało podwyższony poziom CPK (poziomy od 54 – 792 U/l średnio 299.44 U/l, SD 262.9 U/l).

Dyskusja.

Powtarzane wlewy dożylnych immunoglobulin są coraz szerzej stosowanym sposobem leczenia wspomagającego stwardnienia rozsianego [2,9,8]. U pacjentów leczonych okresowymi wlewami dożylnych immunoglobulin obserwuje się spadek częstości rzutów oraz mniejszą ilości oraz objętość nowych plak demielinizacyjnych w stosunku do grupy pacjentów nieleczonych [2,9].
Interleukina 6 jest pro-zapalną cytokiną produkowaną w ośrodkowym układzie nerwowym, która obok TNF-alfa wydaje się odgrywać kluczową rolę w patogenezie chorób zapalnych ośrodkowego układu nerwowego [10,11,12]. Obserwowano wzrost poziomu interleukiny 6 w płynie mózgowo-rdzeniowym u pacjentów w postaci przewlekle postępującej stwardnienia rozsianego oraz u pacjentów z objawami demielinizacji w OUN w przebiegu tocznia układowego [3]. Poziomy osoczowej IL-6 u osób chorujących na stwardnienie rozsiane korelują pozytywnie w różnym stopniu z poziomami IL-6 w płynie mózgowo-rdzeniowym w zależności od postaci oraz aktywności choroby [2,5,7]. Może to wskazywać na istnienie uogólnionego procesu zapalnego towarzyszącego toczącej się w ośrodkowym układzie nerwowym reakcji autoimmunologicznej będącej istotą stwardnienia rozsianego.
Interleukina 10 jest cytokiną o dużym potencjale przeciwzapalnym przejawiającym się w hamowaniu aktywności makrofagów, limfocytów T oraz komórek NK [11,8]. U pacjentów z pierwotnie przewlekle postępującą postacią stwardnienia rozsianego obserwuje się podwyższone poziomy IL-10 w płynie mózgowo-rdzeniowym [8,3], co najprawdopodobniej jest związane z próbą uzyskania kontroli i ograniczeniem kaskadowo narastającego procesu zapalnego w ośrodkowym układzie nerwowym [3].
Zarówno w badaniach in vitro [2,18,21], jak i in vivo w zespole Guillain-Barre obserwowano spadek poziomu IL-6 po podaniu preparatów ludzkich immunoglobulin immunoglobulin [2,10]. Badania in-vitro wskazują na zmniejszenie produkcji IL-6 przez makrofagi pod wpływem nieznanych czynników immunomodulujących zawartych w preparatach immunoglobulin. W badaniach in-vivo obserwowano wzrost poziomu przeciwciał przeciwko IL-6, z jednoczesnym spadkiem poziomu IL-6, po podaniu dożylnych immunoglobulin, co może być dodatkowym mechanizmem prowadzącym do spadku poziomu IL-6, jednak nie tłumaczy utrzymującej się przez dłuższy czas redukcji stężeń IL-6 w surowicy pacjentów [19]. We wcześniejszych publikacjach rozważano bezpośredni wpływ uszkadzający dożylnych immunoglobulin na aktywowane limfocyty T i inne komórki produkujące prozapalne cytokiny, w tym IL-6, jednakże nie znaleziono dotychczas dowodów na niszczenie tych komórek po podaniu immunoglobulin, a rosnący poziom IL-2, która jest produkowana przez aktywowane limfocyty T w fazie efektorowej reakcji immunologicznej, świadczy przeciwko tej teorii [10]. Innym sugerowanym mechanizmem działania dożylnych immunoglobulin na produkcję cytokin jest kumulacja immunoglobulin w otoczeniu limfocytów co może być sygnałem do zaprzestania produkcji zapalnych cytokin przez limfocyty T [22].
W badaniach in vitro z użyciem krwi pacjentów ze stwardnieniem rozsianym obserwowano zależny od dawki podawanych immunoglobulin spadek produkcji prozapalnych cytokin TNF-alfa i interferonu-gamma oraz wzrost produkcji i wydzielania przeciwzapalnej interleukiny 10 [22]. W badaniach nad skutecznością leczenia stwardnienia rozsianego octanem glatirameru wykazano znamienny wzrost przeciwzapalnych cytokin IL-12 i IL-10 korelujący ze stabilizacją kliniczną [6]. U pacjentów ze stwardnieniem rozsianym leczonych interferonem B-1b wykazano korelację skuteczności leczenia, kontrolowanej seryjnymi badaniami neuroobrazowymi, a osoczowymi stężeniami receptorów dla TNF-alfa (TNFR1 i TNFR2) [7].
U badanych przez nas pacjentów nie obserwowano spodziewanego spadku poziomu prozapalnej interleukiny-6, ani wzrostu przeciwzapalnej interleukiny-10. Z jednej strony, może być to spowodowane niską dawką immunoglobulin stosowaną w trakcie badania, a z drugiej brakiem aktywności procesu uszkadzającego ośrodkowy układ nerwowy, a tym samym utrzymaną szczelnością bariery krew-mózg, która mogła skutecznie uniemożliwić dotarcie substancji immunologicznie aktywnych, zawartych w dożylnych immunoglobulinach, do komórek efektorowych i regulujących proces autoimmunologiczny, znajdujących się w tkance ośrodkowego układu nerwowego.

Wnioski:
Dożylne immunoglobuliny w dawce 2,5g nie mają wpływu na osoczowe stężenia IL-6 i IL-10 u pacjentów w fazie stabilizacji klinicznej stwardnienia rozsianego.
W celu lepszego poznania mechanizmów działania immunomodulującego dożylnych immunoglobulin u pacjentów ze stwardnieniem rozsianym, celowe wydaje się dokonanie oceny wpływu większych dawek dożylnych immunoglobulin na IL-6 i IL-10.
Ustalenie minimalnej dawki dożylnych immnoglobulin, w trakcie stosowania której obserwowane będzie zmniejszenie poziomu prozapalnej IL-6 i/lub przeciwzapalnej IL-10, pozwoli na uzyskanie podstaw teoretycznych do ustalenia minimalnej dawki dożylnych immunoglobulin poddanej ocenie skuteczności w leczeniu pacjentów chorujących na stwardnienie rozsiane.